项目文章（IF=48.8）| 单细胞测序助力结直肠癌肿瘤基质免疫细胞类群生态位微环境研究

肿瘤微环境（TME）由增殖的恶性肿瘤细胞、异质性的免疫细胞、多种成纤维细胞以及血管淋巴管内皮细胞和细胞外基质元素组成。TME中免疫细胞的组成、空间结构和功能状态对肿瘤免疫逃逸和进展以及对免疫治疗的响应性产生重大影响。

调节性T细胞（Treg）特异性表达转录因子Foxp3，在调节免疫稳态和炎症反应方面发挥着不可或缺的作用。尽管已有许多研究表明肿瘤微环境中Treg细胞在肿瘤逃逸机体免疫反应中具有十分重要的作用，然而Treg细胞在肠道肿瘤微环境中的分布特征、状态维持以及功能作用机制并不清楚。

2024年7月18日，细胞应激生物学国家重点实验室、厦门大学生命科学学院、翔安医院毛开睿团队在Cancer Cell（IF=48.8）杂志上在线发表了题为“Lymphatic-localized Treg-mregDC crosstalk limits antigen trafficking and restrains anti-tumor immunity”的研究论文，揭示了肿瘤微环境中Treg独特的空间定位及其抑制抗肿瘤免疫反应的新机制。华大科技为该项目提供高通量单细胞测序服务。

单细胞转录组技术

研究设计及分析思路图

主要结果

01

单细胞研究助力确定肿瘤基质部位形成Treg-mregDC-淋巴管生态位

利用多重免疫荧光技术和小鼠自发性肠道肿瘤模型（Apc^Min/+小鼠），研究人员对肿瘤微环境中的主要免疫细胞亚群进行染色，发现大量的Foxp3⁺ Treg细胞特异性地聚集在肿瘤边缘的基质部淋巴管周围（图1）。这表明Treg被招募到淋巴周围基质区域，进而抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤进展。

图1 Treg特异性聚集在肿瘤基质部淋巴管周围

Bulk RNA-seq和TCR-seq发现肿瘤浸润的Treg高度激活。对肿瘤中免疫细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，共获得个23,932高质量细胞转录组，细胞聚类得到了七个主要细胞类群（图2）：B细胞、T细胞和先天淋巴细胞（T/ILC）、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞（DC）。对Treg细胞进一步分群，发现TME中Treg细胞活化状态存在异质性，其中一部分细胞呈现活化特征，而另一部分则维持静息状态。对DC细胞分群，分为四类：mregDC、cDC1、cDC2、pDC。研究人员进一步探究了DC和Treg之间的相关性，发现Treg和富含免疫调节分子的成熟树突状细胞（mature dendritic cells enriched in immunoregulatory molecules, mregDCs）存在极高的配体-受体相互作用（图3）。免疫荧光染色进一步验证了Treg与mregDC共同聚集在淋巴管周围，研究人员将此空间分布特征命名为Treg-mregDC-淋巴管生态位（图4）。

图2 细胞分群得到的主要细胞类型，T细胞和DC细胞亚群

图3 DC细胞亚群标志基因和Treg标志基因的相关性分析

图4 肿瘤基质部形成Treg-mregDC-淋巴管生态位

02

Treg-mregDC-淋巴管生态位维持Treg细胞活化表型

为了研究Treg活化表型与其空间分布特征之间的关联，研究人员使用PD-1和OX-40以及Foxp3来表征活化Treg，利用多重定量免疫荧光技术，揭示了PD-1^high和OX-40^high Treg在空间位置上与mregDC的紧密相邻（图5）。同时，Nur77报告基因小鼠（Nr4a1^GFP）也表明是Treg和mregDC的空间上的紧密作用使Treg在肿瘤微环境局部活化。当利用MHC-II抗体阻断Treg与mregDC的相互作用后，Treg细胞表面活化相关分子（PD-1、CTLA-4、TIM-3、OX-40和ICOS）的表达水平下降，Treg活化受损。这些证据表明Treg和mregDC之间的互作促进并维持肿瘤微环境中Treg的活化状态，从而增强其在TME的免疫抑制功能。

图5 活化的Treg和mregDC在空间位置上紧密相邻

03

CCR4介导Treg-mregDC-淋巴管生态位的形成，促进肿瘤免疫逃逸

除了通过细胞膜表面分子直接接触外，mregDC还有可能通过分泌趋化因子及受体CCL22/17-CCR4将Treg招募到其周围。研究人员构建了结直肠癌（Apc^Min/+）背景下Treg特异性CCR4缺陷小鼠（Apc^Min/+ Foxp3^Cre Ccr4^fl/fl），当Treg缺失CCR4后，小鼠肿瘤的生长受到明显的抑制（图6）。为了验证该趋化作用在Treg-mregDC-淋巴管生态位形成中的作用，研究人员将Ccl22^tdTomato和Ccr4^-/- Ubi-GFP骨髓细胞移植到辐照后的Apc^Min/+小鼠中，构建了混合骨髓嵌合小鼠，发现CCR4缺失的Treg细胞无法准确定位到mregDC周围，因而也无法获得活化的表型特征。这些结果表明mregDC通过CCL22/CCL17-CCR4招募Treg，通过相互作用激活Treg活化表型，从而建立免疫抑制微环境促进肿瘤免疫逃逸。

图6 Treg缺失CCR4抑制小鼠肿瘤的生长

04

Treg抑制mregDC将肿瘤抗原携带到肿瘤引流淋巴结，从而限制抗肿瘤免疫反应的起始

接下来，研究人员进一步探讨了Treg如何在Treg-mregDC-淋巴管生态位中发挥抑制抗肿瘤免疫应答的功能。mregDC具有独特的成熟和迁移特征（高表达CD80、CD86和CCR7），能够携带肿瘤抗原迁移到肿瘤引流淋巴结（tdLN），负责启动和维持有效的适应性免疫反应。研究人员通过在肿瘤原位注射荧光标记的卵清蛋白（FITC-OVA）以模拟肿瘤抗原，发现tdLN中携带FITC-OVA的迁移性DC数量明显减少。当特异性清除Treg或阻断Treg与mregDC相互作用能明显增强肿瘤抗原向引流淋巴结的转运（图7），同时促进识别肿瘤免疫抗原T细胞在引流淋巴结中的增殖。研究人员还发现清除Treg或阻断Treg与mregDC相互作用后，肿瘤中mregDC上CCR7、CD80和CD86表达水平显著上升，从而增强其携带肿瘤抗原到tdLN的迁移。综上所述，mregDC是Treg抑制肿瘤免疫的主要靶点。在TME中，活化的Treg通过与mregDC的相互作用抑制肿瘤抗原到tdLN的转运过程，阻碍抗肿瘤适应性免疫应答的起始，进而促进肿瘤的发生发展。

图7 Treg以CTLA-4依赖方式抑制肿瘤抗原到引流淋巴结的转运

05

Treg与mregDC的互作也存在于人类结直肠癌中并导致不良预后

为了探究Treg与mregDC的相互作用是否也存在于人类肿瘤中，研究人员对已发表的结直肠癌的空间转录组数据进行深入分析，发现活化Treg和mregDC的特征基因也聚集性地分布在肿瘤基质的淋巴管周围，形成与Apc^Min/+小鼠同样的Treg-mregDC-淋巴管生态位。接下来，研究人员进一步评估了Treg和mregDC之间的这种空间互作对肿瘤预后的影响。通过对TCGA数据库数据的分析，研究人员发现活化Treg特征基因表达水平低同时高表达mregDC特征基因（mregDC^high actTreg^low）的肿瘤患者具有显著的生存优势。这些结果与小鼠模型中的现象一致，表明Treg和mregDC在人类肿瘤淋巴管周围的互作构成了阻碍抗肿瘤免疫应答的抑制性免疫微环境，从而降低患者生存率。

图8 mregDC、活化Treg特征基因不同表达程度的肿瘤患者总生存期

研究亮点

01

多种研究技术联合发掘生物学机制

（多重免疫荧光和高通量单细胞技术等）

02

 研究发现和多角度验证相结合

（构建小鼠模型和引用已有临床数据验证）

总结

研究团队在肿瘤基质中发现了一个独特的Treg-mregDC-淋巴生态位（Treg-mregDC-lymphatic niche）。通过与mregDC的相互作用，调节性T细胞（Treg）获得激活状态，并上调抑制性和共刺激表面分子，反向又抑制mregDC迁移到引流淋巴结，限制肿瘤抗原呈递，从而阻碍抗肿瘤适应性免疫反应的启动（图9）。这项研究揭示了肿瘤抑制性免疫微环境的空间组织结构、驱动其形成的分子机制及其相应的生理功能。这不仅加深了我们对肿瘤免疫逃逸的理解，还为肿瘤免疫治疗提供了新的策略。

图9 图文摘要

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参考文献：

[1] You, S., et al. "Lymphatic-localized Treg-mregDC crosstalk limits antigen trafficking and restrains anti-tumor immunity." Cancer Cell (2024). https://doi.org:10.1016/j.ccell.2024.06.014.

供稿：王梦琪、姜莹

编辑：市场部

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